水產養殖技術的部落格

2-2. 細胞性（cellular）免疫：

1. 血球的功能與種類

甲殼類血球細胞以型態和功能分類可將血球細胞分為三種型態，分別是透明球（hyaline cells）、半顆粒球（semigranular cells）及顆粒球（granular cells）（Bauchau, 1981），血球細胞大致功能包括有原酚氧化酵素系統（proPO system）、吞噬作用（phagocytosis）、胞封作用（encapsulation）、癤結形成（Noddule formation）及細胞毒殺作用（cytotoxicity）（Johansson et al., 1995）。

(1)透明球（hyaline cells）：

透明球(或稱無顆粒球)為典型的吞噬細胞，缺乏原酚氧化酵素活性（Phenoloxidase activity），其吞噬活性會受到原酚氧化酵素（prophenoloxidase, proPO）系統活化的物質刺激而增加。不具有顆粒細胞或只有微量顆粒細胞，主要功能為吞噬作用（Smith and Söderhäll, 1983；Söderhäll and Smith, 1986；Johansson et al., 2000）及釋出與凝血有關的酵素transglutaminase（Söderhäll and Cerenius, 1992）。透明血球體積較小，核質比（nucleus-to-cytoplasm ration）最高。此外，透明血球吞噬外來物之後會產生一連串的高活性氧族群（Radical Oxygen Intermediates；ROIs）反應，反應過程會產生超氧離子（superoxide anion, O2-）等具有殺菌能力的物質（Bell and Smith, 1993）。

(2)半顆粒球（semigranular cell）：

半顆粒球(或稱小顆粒球)之大小及核質比介於透明球和顆粒球之

間，含有微量顆粒細胞及內質網，並具有偽足（Mix and Sparks, 1980），受到脂多糖類（lipopolysaccharides；LPS）或葡聚糖β-Glucan刺激後會將胞內顆粒釋出，誘發出其他防禦反應。此外，半顆粒球還具有細胞毒殺（cytotoxicity）（Söderhäll and Cerenius, 1992）、胞封作用（encapsulation）（Johansson and Söderhäll, 1989；Söderhäll and Cerenius, 1992）、原酚氧化酵素（prophenoloxidase, proPO）系統的活化（Johansson and Söderhäll, 1985）以及微弱的吞噬作用等（Smith and Söderhäll, 1983）。

(3)顆粒球（granular cell）：

顆粒球(或稱大顆粒球)為三種血球中體積最大、核質比最小、細胞核緻密並成腎型或馬蹄型，含有大量的顆粒（Bauchau, 1981），主要功能為原酚氧化酵素系統（proPO）活化、細胞毒殺（cytotoxicity）及有限的胞封作用。顆粒細胞之顆粒釋出不會受到脂多糖類LPS或葡聚糖β-Glucan而產生作用，必須經由酯多糖鍵結蛋白（LPS-binding protein）、葡聚糖鍵結蛋白（β-Glucan binding protein）以及peroxinectin（76 kDa蛋白質）作用後才會釋出顆粒（Johansson and Söderhäll, 1989；Söderhäll and Cerenius, 1992）。

三、甲殼類免疫反應之指標因子

(1)總血球數(Total haemocyte counts, THC)

甲殼類的血球細胞參與許多重要的防禦機制，甲殼類血球細胞主要是由體內造血組織haematopoietic tissue(HPT)所生成(Johanson et al., 2000)。目前在甲殼類之免疫因子研究中血球數的變化為一項重要的觀察指標。甲殼類的總血球數會受到內在因子(性別、脫殼週期、年齡、攝食率及季節變化的影響)和外界因子(污染物、溫度、pH值、鹽度及溶氧等)所影響(Gheng and chen, 2002b)。Le Moullac et al. (1998)將蝦子放在hypoxia(1 mg O2 ml-1)測量其總血球數(Total haemocyte counts, THC)，結果顯示其THC明顯減少。許多學者亦指出，當甲殼類暴露在高汙染或重金屬的緊迫環境下，會造成THC降低，而導致免疫能力下降(Smith and Johnson, 1992 ; Victor, 1993 ; Smith et al., 1995)。Cheng and Chen(2002a)指出甲殼類在低總血球數時，生物體對病源體的感受性較高，使宿主容易受病源感染，而引發疾病的產生。

(2)高活性氧族群（Radical Oxygen Intermediates；ROIs）：

吞噬作用是無脊椎動物（invertebrates）抵抗外來異物重要的細胞性防禦機制（Bayne, 1990），當吞噬細胞吞噬外來異物和微生物後，為除去被吞噬物，吞噬細胞會產生高活性氧族群（Radical Oxygen Intermediates；ROIs），此過程即為呼吸爆（respiratory burst）。在呼吸爆的過程中，細胞吞噬外來異物和微生物形成吞噬胞（phagosome），再藉由耗氧量反應上升，合成具有殺菌功能的ROIs。此耗氧上升的反應機制主要在細胞膜上的NADPH氧化酵素（nicotinamide adenine dinucletotide phophate oxidase），利用電子供應者NADPH或NADH將氧分子（O2）還原（Babior et al., 1973），再經由NADPH氧化酵素催化作用後產生超氧陰離子（superoxide anion radical；O2-），之後再經由超氧化歧化酵素（superoxide dismutase, SOD）催化形成過氧化氫（H2O2）（Holmblad and Söderhäll, 1999），過氧化氫（H2O2）可經由catalase或peroxidase轉化成水（H2O）及氧分子（O2），而O2-與O2-間的碰撞亦會形成另一個過渡產物，即電激發態的單線氧（singlet oxygen, O21），此外還有氫氧自由基（hydroxyl raicals, OH-）產生，與H2O2 可經myeloperoxidase（MPO）- H2O2 -Cl 系統轉換為次氯酸（hypochlorous acid, OCl-）（Bayne, 1990；Anderson, 1996）等具有殺菌的物質。ROIs雖然具有殺菌的功能，但對於宿主本身亦造成傷害，因此需藉由SOD來去除過多的O2-，抑制ROIs過多的反應（Holmblad and Söderhäll, 1999）。ROIs反應過程中產生的超氧陰離子（superoxide anion radical；O2-），具有強烈的殺菌功能。O2-為第一個產生的ROIs殺菌物質，因此藉由檢測血球中的O2-生成量，可以做為甲殼類細胞性防禦機制的一個指標(Ratclife et al., 1985)。ROIs反應式如下：

 (3)超氧化歧化酵素（superoxide dismutase, SOD）：

超氧化歧化酵素（SOD）是一種廣泛存在各種生物體內的抗自由基酵素，無論在好氧性或厭氧性的真核或原核生物中，均可發現它的存在。SOD是一種抗氧化活性的生物酵素，目前為止唯一發現SOD是以O2-做為基質來反應的酵素（McCord, 1979；Wong et al., 1991）。O2-檢測方式是在ROIs反應過程中，利用Nitroblue tetrazolium（NBT）reduction technique 先後檢驗出草蝦及白蝦血球中O2-的產生（Song and Hsieh., 1994；Muñoz et al., 2000）。SOD為含有金屬的蛋白酵素，根據其活性位置所結合的金屬輔酵素因子的不同而被區分為：銅鋅型超氧化歧化酵素（Cu/Zn-superoxide dismutase）、錳型超氧化歧化酵素（Mn-superoxide dismutase）以及鐵型超氧化歧化酵素（Fe-superoxide dismutase）（Bannister et al.,1987）三大類型。

(4)原酚氧化酵素系統（proPO system）：

原酚氧化酵素系統Prophenoloxidase activation system亦稱Phenoloxidase反應是甲殼類及昆蟲體腔內的一種黑色素化酵素，許多研究發現大部分的無脊椎動物都具有proPO酵素系統，其被認為在無脊椎動物的防禦系統中佔有相當重要的地位。在昆蟲的研究中指出，proPO酵素活性主要存在血漿(plasma)中，而在甲殼類(包括對蝦類) proPO酵素活性則主要存在於顆粒球與半顆粒血球之中(Söderhäll and Smith, 1986；Srtiunyalucksana and Söderhäll, 2000)。當生物體受傷時為避免血淋巴的流失與感染後，PO會產生具毒殺性的quinonoid物質在傷口處殺死入侵物質，並立即形成黑色素進行傷口癒合作用(Chase et al., 2000)；在細菌或寄生蟲感染後，若吞噬作用無法進行時，PO會促使癤結形成或胞封作用的進行(Söderhäll et al., 1990)。

proPO system是一種與補體系統相似的酵素系統（complement-like enzyme cascade），其中與補體系統不同的是此系統中的因子是以非活化的狀態存在於甲殼類的顆粒球血球與半顆粒血球之中（Söderhäll and Smith, 1986）。proPO system包括有proPO、76 kDa蛋白質、proPO活化酵素（prophenoloxidase activating enzyme, ppA）及β-Glucan binding protein等。半顆粒血球經由LPS與β-Glucan直接刺激後釋出活化的原酚氧化酵素（proPO）；另外顆粒血球是由β-Glucan與β-Glucan binding protein結合後刺激血球釋出proPO，而未活化的proPO system亦可能經由β-Glucan與β-Glucan binding protein結合後複合物、LPS、peroxinectin（76 kDa蛋白質）、Heat及低濃度鈣離子刺激後活化。proPO被proPO活化酵素活化成酚氧化酵素（phenoloxidase, PO）。